Please use this identifier to cite or link to this item:
https://hdl.handle.net/10216/171325| Author(s): | Eva Moia Silva Reis |
| Title: | Development of glycoengineered CRISPR knock-out organoid models to study gastric carcinogenesis |
| Issue Date: | 2025-11-28 |
| Abstract: | Gastric Cancer (GC) is the 4th leading cause of cancer-related deaths worldwide, mainly due to its asymptomatic progression and late diagnosis. Additionally, GC is characterized by extensive heterogeneity, which makes it challenging to identify targeted therapies suitable for clinical translation. A key manifestation of this heterogeneity is the diverse genetic mutational landscape observed across different GC subtypes. One of the most frequent alterations is the early loss of p53 function, occurring at the initial stages of disease development. Intestinal-subtype GC develops through a cascade, from chronic inflammation to intestinal metaplasia (IM), dysplasia, and cancer. Glycan pathways deregulation has been long described with several steps of malignant progression. One of the most described events is the expression of sialylated Lewis's antigens, such as sLeX and sLeA associated with chronic inflammation, which is sustained in tumors. Another remarkable event is the de novo expression short O-glycans, namely sTn, upon IM, which is maintained in the tumoral context. Yet, the molecular triggers and mechanisms of this deregulation remains unclear, partly due to the lack of longitudinal models that recapitulate carcinogenesis overtime. In this work, we validated the applicability of gastric PDOs as ex vivo models of gastric carcinogenesis, faithfully recapitulating key steps of the cascade through the expression of classical malignant markers as well as aberrant glycan epitopes. Furthermore, we successfully established a CRISPR-based glycoengineering protocol for both tumoral and non-tumoral gastric PDOs, providing a versatile platform to dissect the molecular basis of malignant transformation. A glycoengineered PDO line inducing the aberrant overexpression of Tn and sTn in normal PDOs revealed a potential association between short O-glycans and abnormal cell differentiation, although it was insufficient to trigger malignant transformation alone. Overall disruption of fucosylation and sialylation structures was observed, highlighting the interplay between parallel glycosylation routes. Additionally, a TP53KO model was established to mimic the early p53 loss in gastric carcinogenesis. Loss of p53 promoted a shift toward malignancy and led to a disruption of glycan pathways with the accumulation of Tn and sTn structures. Moreover, rewiring of MAPK signalling pathways was identified, suggesting a compensatory mechanism for p53 deficiency. Overall, our findings demonstrate that genetic engineered gastric PDOs, provide a robust and versatile platform to study the molecular mechanisms of gastric carcinogenesis. This approach allows the dissection of the interplay between glycosylation alterations and key oncogenic events, offering valuable insights into the early stages of malignancy and potential avenues for the development of targeted therapies. Keywords: Glycosylation; Gastric carcinogenesis; Patient-derived organoids; CRISPR-KO |
| Description: | O cancro gástrico (CG) é a quarta maior causa de morte relacionadas com o cancro a nível mundial, principalmente devido à sua progressão assintomática e ao diagnóstico tardio. Para além disso, o CG caracteriza-se por uma vasta heterogeneidade, o que torna difícil identificar terapias alvo passíveis de aplicação clínica. Uma das principais manifestações desta heterogeneidade é o diverso panorama de mutações genéticas observadas nos diferentes subtipos de CG. Uma das alterações mais frequentes é a perda precoce de p53, que se observa nas fases iniciais do desenvolvimento da doença. O cancro gástrico do subtipo intestinal desenvolve-se através de uma cascata de eventos, que progride ao longo de décadas desde a inflamação crónica até à metaplasia intestinal (MI), displasia e, por fim, cancro. A desregulação das vias de glicanos tem sido amplamente descrita em todas as etapas da progressão maligna. Um dos eventos mais descritos é a expressão de antigénios Lewis sialilados, como sLex e sLea, no contexto da inflamação crónica, mantido também no tumor. A expressão de novo de O-glicanos truncados, nomeadamente sTn, durante a Mmi é outro evento que marca a progressão maligna, e os níveis mantêm-se elevados no contexto tumoral. No entanto, os mecanismos moleculares que desencadeiam esta desregulação permanecem pouco claros, em parte devido à ausência de modelos longitudinais que recapitulem a carcinogénese ao longo do tempo. Neste trabalho, validámos a aplicabilidade de patient-derived organoids (PDOs) gástricos como modelos ex vivo de carcinogénese gástrica, reproduzindo fielmente os principais passos da cascata através da expressão de marcadores malignos clássicos, bem como glicanos aberrantes. Para além disso, estabelecemos com sucesso um protocolo para manipulação de genes associados com glicosilação baseado nas técnicas de CRISPR, aplicável a PDOs gástricos tumorais e não tumorais, oferecendo uma plataforma versátil para dissecar a base molecular da transformação maligna. Uma linha geneticamente modificada de organoides normais induzindo a sobre expressão de Tn e sTn revelou uma potencial associação entre estes O-glicanos truncados e uma diferenciação celular anormal, não constituindo, no entanto, condição suficiente para desencadear a transformação maligna. Observou-se uma perturbação geral das vias de fucosilação e sialilação, evidenciando a interligação entre vias de glicosilação paralelas. Para além disso, foi estabelecido um modelo TP53KO para mimetizar a perda precoce de p53 na carcinogénese gástrica. A perda de p53 promoveu uma transição para um fenótipo associado com pré-malignidade e conduziu à desregulação das vias de síntese de O-glicanos com acumulação das estruturas Tn e sTn. Mais ainda, foi identificada uma reorganização das vias de sinalização MAPK, sugerindo um mecanismo compensatório para a deficiência de p53. No geral, resultados demonstram que os organóides gástricos geneticamente modificados fornecem uma plataforma robusta e versátil para estudar os mecanismos moleculares da carcinogénese gástrica. Esta abordagem permite dissecar a interligação entre alterações na glicosilação e eventos oncogénicos, oferecendo informações valiosas sobre as fases iniciais da malignidade e potenciais estratégias para o desenvolvimento de terapias alvo. |
| Subject: | Ciências médicas e da saúde Medical and Health sciences |
| Scientific areas: | Ciências médicas e da saúde Medical and Health sciences |
| URI: | https://hdl.handle.net/10216/171325 |
| Document Type: | Dissertação |
| Rights: | embargoedAccess |
| Embargo End Date: | 2026-11-27 |
| Appears in Collections: | FMUP - Dissertação |
Files in This Item:
| File | Description | Size | Format | |
|---|---|---|---|---|
| 751038.pdf Restricted Access | Development of glycoengineered CRISPR knock-out organoid models to study gastric carcinogenesis | 5.89 MB | Adobe PDF | View/Open |
Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.