Plantas transgénicas : Transformação de Nicotiana tabacum L. utilizando a GFP. Análise da transgenia de Nicotiana tabacum L. transformada com cDNA da cardosina A

Abstract

As plantas transgénicas são de enorme importância porque permitem o estudo de fenómenos biológicos complexos, representam potenciais recursos para a produção de certos compostos, diminuindo a agressividade no ambiente, e são utilizadas como meios de combate a certas doenças, a nível da saúde mundial como é o exemplo do arroz dourado. O presente trabalho tem por objectivo transformar plantas de Nicotiana tabacum utilizando a GFP como gene repórter e analisar plantas de Nicotiana tabacum transformadas com o cDNA da cardosina A. Antes da transformação das plantas, a cultura de tecidos de Nicotiana tabacum ocorreu por organogénese directa a partir de explantes de folhas e por enraizamento de ápices caulinares. Os explantes foram transferidos para um meio suplementado com hormonas (benziladenina e isopenteniladenina) e os ápices transferidos para o meio apropriado para o seu enraizamento (MSB5). A transformação das plantas foi efectuada pelo método de transformação mediada pelo Agrobacterium. Este método é o mais frequentemente utilizado neste tipo de procedimentos. O Agrobacterium utilizado foi transformado com o vector binário pCAMBIA1302 que contém um gene de resistência à higromicina, htpII, para selecção de plantas transformadas, um gene de resistência à kanamicina, nptII, para selecção do plasmídio em bactérias, um local de clonagem múltipla derivado do pUC18 e um gene repórter, gfp. O gene repórter é um mutante, mgfp5*. A presença da GFP permitiu confirmar a transgenia das plantas, uma vez que a selecção pelo antibiótico higromicina B (50 mg/mL) levava à morte das plantas quando permaneciam muito tempo no mesmo. Através de cortes dos órgãos das plantas observados ao microscópio de fluorescência, a GFP permitiu visualizar as plantas transformadas uma vez que a GFP fluoresce de verde quando excitada com UV. A transgenia foi ainda confirmada com PCR do DNA genómico e RT-PCR do RNA total das plantas.Neste trabalho também se estudou a transgenia de Nicotiana t ...