Please use this identifier to cite or link to this item: https://hdl.handle.net/10216/10804
Author(s): Tavares, Joana Alexandra Pinto da Costa
Title: Antileishmanial Drugs: search for t SIR2 inhibitors
Publisher: Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto
FFUP
Issue Date: 2011-02-07
Abstract: Leishmaniasis is a parasitic disease, caused by the protozoa of the genus Leishmania that affects millions of people worldwide, especially in tropical and subtropical areas, and is responsible for high mortality and morbidity. Disease control is dependent on drug therapy, since no approved human vaccine is available. However, the existing therapy is far from satisfactory owing to the emergence of resistances, toxicity and its limited efficacy due to disease exacerbation, mainly associated with compromised immune capability. The proteins belonging to the Silent Information Regulator 2 (SIR2) family, also known as Sirtuins are conserved throughout evolution and are classified as class III histone deacetylases (HDAC) due to their dependency on NAD+ to deacetylate lysine residues of histones and non-histone substrates. Moreover, these proteins have been involved in the regulation of a number of biological processes such as gene silencing, DNA repair, longevity, metabolism, apoptosis, and development. One of the three SIR2 homologues identified in the Leishmania genome, the SIR2RP1, is localized in the cytosol and, according to indirect molecular as well as biological approaches, seems to be involved in parasite survival. A genetic approach through the disruption of the Leishmania SIR2RP1 encoding gene suggested that this protein was determinant to parasite survival due to the impossibility of generating null chromosomal mutants without episomal rescue. Furthermore, disruption of one LiSIR2RP1 gene allele (LiSIR2+/-) led to decreased amastigote virulence, in vitro as well as in vivo. Biochemical approaches revealed that LiSIR2RP1 has NAD+-dependent deacetylase and ADP-ribosyltransferase activities. Moreover, we found that LiSIR2RP1 is partially associated with the parasite s cytoskeleton and is capable of deacetylating tubulin, either in dimers or, when present, in taxol-stabilized microtubules or in promastigote and amastigote extracts, which may have significant implications during the remodelling of the parasite s morphology and its interaction with the host cell. These findings led us to consider LiSIR2RP1 as a potential therapeutic target. Therefore, aiming at the identification of LiSIR2RP1 inhibitors, an in silico screening of the National Cancer Institute compounds 3D database (NCI-2000) containing approximately 2x105 compounds was conducted, seeking the inhibition of the parasite SIR2 over the human enzyme, SIRT1. Even though this strategy was effective in identifying N-(2-fluorophenyl) nicotinamide, which can be used for lead designing, it failed to identify a truly potent and selective lead compound. The presence of a common structural moiety (naphthalene) in some molecules identified as Sirtuin inhibitors, led us to discover bisnaphthalimidopropyl (BNIP) derivatives as a new class of inhibitors. Structure-activity studies were conducted with 12 BNIP derivatives leading to the identification of BNIPDanonane as a potent and selective inhibitor of the LiSIR2RP1 versus its human counterpart. Indeed, based on kinetic studies, its inhibitory effect is due to competition with NAD+, which is supported by docking analysis of BNIP derivatives in the LiSIR2RP1 and hSIRT1 three-dimensional models. Furthermore all the BNIP derivatives are active in vitro against Leishmania infantum intracellular amastigotes (IC50 lower than 12 M) and at least one of them, BNIPDaoctane, was identified to be active in vivo since its administration reduces the parasite load in the spleen and liver of a visceral leishmaniasis mice model. Therefore, this work will open new perpectives towards the development of LiSIR2RP1 inhibitors, which interfere with the parasite development.
Description: Doutoramento em Bioquímica
PhD Degree - Biochemistry
A leishmaniose é uma doença parasitária causada pelo protozoário do género Leishmania, que afecta milhões de indivíduos, em particular nas regiões tropicais e subtropicais, sendo deste modo responsável por uma elevada mortalidade e morbilidade. Na ausência de vacinas para uso humano, o controlo da doença baseia-se na terapêutica farmacológica. No entanto, os medicamentos disponíveis não são satisfatórios principalmente devido ao aparecimento de resistências, aos efeitos laterais indesejáveis, e sobretudo devido à sua eficácia ser limitada em situações de exacerbação da doença, como a que ocorre em indivíduos com o sistema imunológico comprometido. As proteínas pertencentes à família Silent Information Regulator 2 (SIR2), também designadas de Sirtuins, são proteínas conservadas ao longo da evolução e classificadas como histonas desacetilases (HDAC) da class III, uma vez que dependem do NAD+ como co-factor para desacetilar os resíduos de lisina de diversos substratos. As proteínas incluídas nesta família têm se revelado envolvidas na regulação de vários processos biológicos como o silenciamento de genes, reparação do DNA, longevidade, metabolismo, apoptose e desenvolvimento. No genoma da Leishmania foi identificada a existência de informação genética para codificar três proteínas homólogas às da família SIR2. Uma das proteínas, designada de SIR2RP1, encontra-se localizada no citosol e de acordo com uma abordagem molecular e biológica indirecta parece estar envolvida na sobrevivência do parasita. A impossibilidade de conseguir remover os dois alelos que codificam para esta proteína em Leishmania, sem ter havido suplemento epissomal, sugere um envolvimento determinante da mesma na sobrevivência do parasita. Para além do que, a remoção de apenas um alelo que codifica a proteína LiSIR2RP1 compromete virulência do parasita tanto in vitro como in vivo. A caracterização bioquímica revelou que a proteína LiSIR2RP1 apresenta actividade desacetilase e ADP-ribosiltransferase dependente do NAD+. Adicionalmente, observamos que esta proteína se encontra parcialmente associada ao citoesqueleto do parasita catalizando a desacetilação da tubulina na presença de NAD+. Com base nestes resultados, consideramos a possibilidade de a proteína LiSIR2RP1 representar um potencial alvo terapêutico. Com o objectivo de identificar novas moléculas que inibam a proteína SIR2 do parasita e não a proteína humana correspondente, SIRT1, procedeu-se posteriormente ao rastreio in silico da livraria de compostos do National Cancer Institute 3D database (NCI-2000) contendo aproximadamente 2x105 compostos. Contudo, esta estratégia não permitiu a identificação de um inibidor potente, permitindo apenas a identificação do N-(2-fluorfenil)nicotinamida, que poderá ser posteriormente submetido a modificações químicas. Avaliamos também a capacidade dos compostos derivados do bisnaftalimidopropil (BNIP) inibirem a proteína LiSIR2RP1. A realização de um estudo de relação estruturaactividade, que incluiu 12 derivados do BNIP, a proteína LiSIR2RP1, e a proteína humana correspondente, permitiu identificar os derivados BNIP como uma nova classe de inibidores das Sirtuins. O composto BNIPDanonano foi seleccionado como um inibidor potente e selectivo da enzima LiSIR2RP1. Pela realização de cinéticas enzimáticas e análise computacional de modelos 3D das proteínas, concluímos tratar-se de um inibidor que actua por competição com o NAD+. Verificamos também que todos os compostos derivados do BNIP inibem, em ensaios in vitro, o crescimento da forma amastigota intracelular de L. infantum (IC50 inferiores a 12 M). Pelo menos o derivado BNIPDaoctano foi eficaz a reduzir a carga parasitária no fígado e baço de ratinhos infectados. Este estudo abre novas perspectivas ao desenvolvimento de inibidores da proteína LiSIR2RP1, que interfiram com o crescimento do parasita.
Subject: Bioquímica
Biochemistry
Porto
URI: http://hdl.handle.net/10216/10804
Document Type: Tese
Rights: openAccess
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