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https://hdl.handle.net/10216/175944| Author(s): | Ana Catarina Amorim Santos |
| Title: | Regulation of Pseudomonas aeruginosa RpoS and Las Quorum-sensing genes in response to Candida albicans: a Gene-PNA-FISH study of interkingdom biofilms |
| Issue Date: | 2026-07-22 |
| Abstract: | Polymicrobial biofilms are clinically relevant communities frequently found in chronic wounds, the lungs and on medical devices, such as catheters and ventilator tubes. Candida albicans is present in a substantial proportion of chronic wound infections, often coexisting with Pseudomonas aeruginosa. These mixed species environments are shaped by complex interkingdom interactions that influence microbial growth, morphology, quorum sensing (QS) activity, virulence factors production and antimicrobial tolerance. As a result, they can lead to more persistent infections that are often difficult to treat and less responsive to conventional therapies. Because these processes are strongly dependent on spatial organization, conventional bulk analytical approaches cannot resolve how gene expression and cell localization can jointly determine biofilm behavior. Spatially resolved methods are therefore essential for elucidating the molecular mechanisms and architectural features underlying these interactions and can inform on better strategies to manage chronic polymicrobial infections. In this context, spatial transcriptomics approaches, namely fluorescence in situ hybridization (FISH) using peptide nucleic acid (PNA) probes, can offer a means to directly link gene expression with microbial architecture in intact biofilms. This thesis presents a proof of concept application of a multiplex PNA FISH method to examine the spatial organization and interspecies interactions of P. aeruginosa and C. albicans within biofilms. An mRNA targeted probe for lasI, which encodes the Las QS autoinducer synthetase, was designed, optimized and validated in planktonic cultures, where it reproduced the expected temporal expression pattern, with signal peaking at 6 h and decreasing thereafter. Hybridization conditions compatible with species specific rRNA probes identified 57 ˚C as the optimal temperature for both single and multiplex assays. The optimized method was then applied to mono and dual species biofilms. In P. aeruginosa mono species biofilms, bacterial cells were detected but lasI signals were absent at both 6 and 24 h. In dual species biofilms, P. aeruginosa preferentially attached to the C. albicans hyphal network. The 6 h timepoint appeared to represent early coexistence, whereas at 24 h interspecies effects seemed more pronounced, with reduced fungal filamentation and overall suppression of fungal growth. A shift in lasI spatial distribution also appeared to occur, from a diffuse pattern at early stages to a possible concentration near the substratum at 24 h. Overall, this study highlights multiplex PNA-FISH as a robust tool for spatially resolving complex interactions within P. aeruginosa - C. albicans biofilms. Beyond methodological validation and probe design automation, these findings can enable more detailed investigations on interkingdom dynamics, supporting the further development of mechanistic and clinically meaningful insights on polymicrobial biofilm behavior. |
| Description: | Os biofilmes polimicrobianos são comunidades clinicamente relevantes encontradas frequentemente em feridas crónicas, pulmões e em dispositivos médicos, como cateteres e tubos de ventilação. Candida albicans está presente numa proporção substancial de infeções em feridas crónicas, coexistindo frequentemente com Pseudomonas aeruginosa. Estes ambientes multiespécie são moldados por interações inter-reino complexas que influenciam o crescimento e a morfologia microbiana, a atividade de quorum sensing (QS), a produção de fatores de virulência e a tolerância a agentes antimicrobianos. Como consequência, podem originar infeções mais persistentes, difíceis de tratar e com menor resposta às terapias convencionais. Dado que estes processos dependem fortemente da organização espacial, as abordagens analíticas convencionais em massa não permitem compreender como a expressão genética e a localização celular podem determinar em conjunto o comportamento do biofilme. Assim, métodos com resolução espacial são essenciais para elucidar os mecanismos moleculares e características arquitetónicas que sustentam estas interações, contribuindo para o desenvolvimento de tratamentos mais eficazes contra infeções polimicrobianas crónicas. Neste contexto, métodos de transcriptómica espacial, como a hibridização in situ fluorescente (FISH) com sondas de ácidos nucleicos peptídicos (PNA), oferecem uma forma de relacionar diretamente a expressão genética com a arquitetura microbiana em biofilmes intactos. Esta tese apresenta uma prova de conceito da aplicação de um método PNA-FISH em multiplex para avaliar a organização espacial e interações interespécie de P. aeruginosa e C. albicans em biofilmes. Foi desenhada, otimizada e validada uma sonda direcionada ao mRNA do gene lasI, responsável pela codificação da sintetase do autoindutor do sistema Las QS, em culturas planctónicas. A sonda reproduziu o perfil de expressão temporal esperado, com um pico de sinal às 6 h, seguido de uma posterior diminuição. Considerando a compatibilidade das condições de hibridização com as condições das sondas de rRNA específicas para cada espécie, foi determinada uma temperatura ótima de 57 °C para ensaios individuais e em multiplex. O método otimizado foi posteriormente aplicado a biofilmes de espécie única e de duas espécies. Em biofilmes monoespécie de P. aeruginosa, foram detetadas células bacterianas, mas não foi observado sinal da sonda lasI nem às 6 h nem às 24 h. Em biofilmes de duas espécies, P. aeruginosa demonstrou adesão preferencial à rede de hifas de C. albicans. A observação às 6 h sugeriu um estado inicial de coexistência, enquanto às 24 h as interações interespécie pareceram mais evidentes, com redução da filamentação e supressão do crescimento fúngico. Observou-se também uma possível alteração na distribuição espacial da sonda lasI, passando de um padrão inicialmente difuso para uma aparente concentração junto ao substrato às 24 h. De forma global, este estudo destaca o potencial do método de PNA-FISH em multiplex como uma ferramenta robusta para a análise espacial de interações complexas em biofilmes de P. aeruginosa e C. albicans. Para além da validação metodológica e da automação do desenho de sondas, os resultados obtidos abrem caminho para investigações mais detalhadas das dinâmicas inter-reino, contribuindo para uma compreensão mecanística e clinicamente relevante do comportamento de biofilmes polimicrobianos. |
| Subject: | Nanotecnologia Nano-technology |
| Scientific areas: | Ciências da engenharia e tecnologias::Nanotecnologia Engineering and technology::Nano-technology |
| URI: | https://hdl.handle.net/10216/175944 |
| Document Type: | Dissertação |
| Rights: | embargoedAccess |
| Embargo End Date: | 2029-07-21 |
| Appears in Collections: | FEUP - Dissertação |
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| 787045.pdf Restricted Access | Regulation of Pseudomonas aeruginosa RpoS and Las Quorum-sensing genes in response to Candida albicans: a Gene-PNA-FISH study of interkingdom biofilms | 10.49 MB | Adobe PDF | View/Open |
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