Isolamento e caracterização de proteínas envolvidas na via desnitrificante em Pseudomonas Chlororaphis

Abstract

O crescimento das estirpes DSM 50135 e 50083T de Pseudomonas chlororaphis em condições microaeróbicas na presença de nitrato produziu células com expressão abundante de metaloproteínas. Da estirpe DSM 50135, que se revelou um bom sistema para expressão das proteínas envolvidas na desnitrificação, isolou-se uma azurina (Az626), uma redutase do nitrito contendo cobre (CuNiR) e uma redutase membranar do nitrato (NaR). A indução da desnitrificação na estirpe DSM 50083T revelou-se mais problemática do que na DSM 50135, tendo-se purificado desta estirpe apenas uma azurina (Az624) e, parcialmente, uma proteína com actividade de redutase do nitrito.As azurinas das estirpes de Ps. chlororaphis estudadas (Az624 e Az626) apresentam vários comportamentos que as distinguem das outras azurinas conhecidas. Têm um carácter mais acídico e potenciais de redução mais elevados do que a maioria das azurinas descritas na literatura e apresentam uma dependência do potencial com o pH semelhante à observada em Ps. aeruginosa, mas em que os valores menores de pK das formas oxidadas sugerem maiores mudanças estruturais associadas ao processo de oxidação. Observa-se uma dependência inédita do coeficiente de difusão de Az624 com o pH, que poderá ser devida a mudanças conformacionais, ou à formação de agregados supramoleculares associados ao processo de protonação. Em ambas as azurinas detecta-se estrutura super-hiperfina no espectro de ressonância paramagnética electrónica (RPE) em banda X, comportamento descrito apenas para uma outra azurina, isolada de uma estirpe aparentada, Ps. aureofaciens ATCC 13985 (Zumft et al., 1987).A redutase do nitrito isolada de Ps. chlororaphis DSM 50135 é uma enzima azul, que contém dois tipos de centros de cobre, tipo-1 (T1Cu) e tipo-2 (T2Cu), tal como as restantes CuNiRs conhecidas. Neste trabalho efectuou-se pela primeira vez uma determinação directa dos potenciais de ambos os centros de cobre numa CuNiR: T2Cu, 172 mV e T1Cu, 298 mV a pH 7.6. Embora os valor ...